Responsable: JORGE HUMBERTO SERMENT GUERRERO

Objetivos:

1. Estudiar la participación de diferentes genes en la activación de la respuesta SOS (Auxilio) de Escherichia coli. (La respuesta celular a agentes que dañan su cromosoma o bloquean su replicación se conoce como respuesta SOS)
2. Estudiar la relación que hay entre el tipo de lesión genética y los mecanismos que intervienen para activar dicha respuesta
3. Estudiar la relación entre daño disperso y daño concentrado en radiación de diferente LET (Linear Energy Transfer)

Antecedentes:

El DNA es una de las moléculas más importantes dentro de la célula ya que en ella se encuentra codificada toda la información necesaria para que los seres vivos realicen todas sus funciones. Sin embargo, como cualquier molécula, el DNA está expuesto al ataque de diferentes agentes ya sea físicos o químicos que pudieran alterar su estructura química básica. Dado que el funcionamiento de los organismos en buena medida depende de la integridad del material genético, a lo largo de la evolución gradualmente se han desarrollado diferentes estrategias para enfrentar o contrarrestar dichos daños de acuerdo con dos alternativas, la protección contra tales ataques o bien la reparación de las lesiones que aquellos causen en el genoma. Dentro de los primeros están diversos sistemas enzimáticos que neutralizan el efecto de los agentes tóxicos, inhibiendo su actividad o destruyéndolos antes de que puedan ejercer su acción sobre el genoma. Un ejemplo de estos serían los sistemas que atrapan o eliminan agentes o radicales oxidantes, evitando así que reaccionen con el DNA (Friedberg et al., 1995).

Los segundos son los sistemas de reparación que actúan directamente sobre el material genético ya dañado y poseen diferentes grados de especificidad. Algunos eliminan directamente a la lesión restituyendo de inmediato a la estructura original del DNA y en general reconocen un solo tipo de daño. Un ejemplo clásico de mecanismo de reparación específico es la fotorreactivación, proceso en el que la enzima fotoliasa reconoce los dímeros de pirimidina que surgen por exposición a luz ultravioleta y simplemente rompe los enlaces que se formaron entre las dos pirimidinas adyacentes con lo que se restaura en un sólo paso la estructura original del DNA. Otro ejemplo de este grupo es el de eliminación de grupos alquilo anormales mediante las enzimas alquil-transferasas, que sacan a estos grupos del DNA restaurando al mismo tiempo a la estructura original (revisado en Sancar et al., 2004)

Hay otros procesos menos específicos que pueden reconocer distintos tipos de daños y genéricamente se conocen como mecanismos de escisión. Este tipo de reparación implica el corte y la eliminación de regiones de DNA que contengan daños, ya sea a nivel de una base (reparación por escisión de bases ó REB) o bien de tramos que incluyen un número determinado de nucleótidos (reparación por escisión de nucleótidos o REN) (Sancar et al., 2004). El primero se inicia con la hidrólisis del enlace N-glucosídico de la base dañada, con lo que queda un hueco apurínico o apirimidínico (sitio AP), al que reconocen enzimas, por lo mismo llamadas endonucleasas AP, que al romper el enlace éster fosfato, ya sea dejando una ruptura en la hebra de DNA que por hidrólisis o por eliminación  posteriormente reparará una polimerasa. Una característica importante de este tipo de reparación es su relativa especificidad, ya que las diferentes enzimas que participan en este mecanismo reconocen solamente cierto tipo de bases dañadas (Glassner et al., 1998). El proceso REN implica la liberación de los tramos de DNA de una sola banda que contienen el daño. Es la principal respuesta celular a modificaciones al DNA causadas por agentes muy diversos y por lo mismo puede reconocer una amplia gama de lesiones. Los pasos del proceso son: 1) reconocimiento de la lesión, 2) corte a ambos lados de ésta y 3) separación del tramo que contiene a la lesión (Bhatia et al., 1996). En E. coli todos estos pasos están a cargo de la escinucleasa ABC, también conocida como UvrABC, que consta de tres subunidades. La subunidad A forma un dímero con gran afinidad por el DNA dañado que se adhiere a lugares donde hay alguna alteración. A esto se une la subunidad B que al formar un complejo UvrB-DNA provoca el desprendimiento de UvrA. Al complejo UvrB-DNA se une UvrC que se encarga de romper los enlaces fosfodiéster a ambos lados de la región alterada y por acción de la helicasa UvrD, se libera entonces el oligonucleótido correspondiente. Los huecos resultantes de cualquiera de las dos alternativas antes descritas (REB ó REN) son posteriormente resintetizados por la polimerasa I de DNA (Lin y Sancar, 1992).

Otra opción importante de recuperación al daño es la de recombinación, que implica intercambio de material de moléculas de DNA distintas. El fenómeno de recombinación se presenta en todos los seres vivientes y su único requisito es que haya al menos dos copias de DNA. En esencia el proceso se refiere al paso de secciones de una molécula de DNA a otra diferente, ya sea en forma recíproca, es decir que haya intercambio entre ambas o no recíproca, en donde solamente una de ellas recibe material nuevo. Esta transferencia puede llevarse a cabo en regiones con secuencias similares (recombinación homóloga) o bien por la unión de extremos de DNA (recombinación no homóloga) evento que se da principalmente en eucariontes y de manera muy reducida en la mayoría de las bacterias, si bien en otras como Deinococcus radiodurans ó Bacillus subtilis parece ser un mecanismo primordial (Kuzminov, 1999). El proceso es muy importante ya que la recombinación es la única posibilidad de componer el daño en el caso de rupturas en la doble banda (RDB), puesto que al perderse la continuidad de la hebra de DNA no hay un molde a partir del cual resintetizarla, lo cual conduce a la muerte de la célula. Puede también intervenir para tolerar lesiones durante el proceso de duplicación de DNA: cuando la polimerasa que cataliza la síntesis del DNA nuevo encuentra una lesión ilegible (dímero, aducto, etc.), interrumpe el proceso y prosigue varios nucleótidos más adelante, dejando un hueco enfrente del sitio donde se halla el daño. Para resolver este problema la célula lleva a cabo un evento de recombinación no recíproca, en el que una molécula homóloga de DNA cede el fragmento homólogo para así rellenar el hueco que quedó en la hebra recién sintetizada (Kuzminov, 1999). En E. coli existen dos vías principales de recombinación homóloga, la vía RecBCD y la vía RecFOR, aunque en algunas bacterias existe también la vía RecE que depende de la presencia del profago rac. La más importante es la que lleva a cabo RecBCD ya que es la principal responsable de la reparación de rupturas dobles. Esta enzima reconoce los extremos rotos del DNA y degrada el extremo 3’ hasta encontrar una secuencia específica denominada sitio chi (llamado así por sus siglas en inglés crossover ), en donde laƒÓhotspot instigator, comúnmente se representa con la letra griega  subunidad RecD cambia de polaridad y degrada en el lado 5’ de modo que se genera un extremo 3’. Al mismo tiempo la enzima promueve la polimerización de RecA sobre esta cadena. Esta proteína por su parte, se encarga de intercambiar dicha banda con su secuencia homóloga en una molécula intacta y posteriormente la polimerasa I del DNA se encarga de sintetizar la parte faltante (Kuzminov, 1999). La vía RecFOR por su parte se encarga de la recombinación en tramos de DNA de cadena sencilla (huecos). Cabe mencionar que estos huecos pueden formarse por la actividad de nucleasas como RecJ ó Exo I a partir de cortes de cadena sencilla o bien por la interrupción de la síntesis de DNA. Al formarse este tipo de estructuras la enzima SSB (por sus siglas en inglés single-strand binding protein) se pega a ellos para protegerlo y darle estabilidad. Posteriormente el complejo FOR (formado por las subunidades RecF, RecO y RecR) se encarga de retirar a SSB y promueve la entrada de RecA, que realiza el intercambio con la secuencia homóloga de otra molécula de DNA (Umezu y Kolodner, 1993; Umezu y Kolodner, 1994)

Otro mecanismo de respuesta celular al daño genético estudiado principalmente en Escherichia coli es la llamada respuesta SOS, que se activa al ocurrir lesiones en el DNA para dar a la bacteria mayores oportunidades de sobrevivir (Courcelle et al., 2001, Serment et al., 2005). Dicho sistema está formado por alrededor de 60 genes de defensa cuya expresión se activa al ocurrir lesiones en el material genético (Fernández de Henestrosa et al., 2000; Courcelle et al., 2001). El producto de recA actúa como regulador positivo y el de lexA como represor del sistema. LexA es un homodímero formado por dos subunidades, cada una de 22.7 kD, unidas a través de sus extremos carboxílicos (Thliveris et al., 1991). Gracias a la atracción de los extremos amino, el dímero reconoce y se pega a una secuencia consenso que se conoce como “caja SOS”, presente en todos los operadores de los genes pertenecientes a esta vía e impide el reconocimiento por la polimerasa de RNA, con lo que bloquea la transcripción. Cuando ocurre alguna lesión o se interrumpe la síntesis de DNA se genera una señal que promueve el paso de la proteína RecA al llamado estado activo y donde funciona como coproteasa al promover la autodegradación de LexA con lo que se incrementa la expresión de los genes de la vía. Un aspecto importante en cuanto a la respuesta SOS es que su actividad se puede regular de acuerdo con el grado de daño causado sobre el material genético. Así, el momento de la transcripción, la duración y el nivel de expresión de cada gen SOS varía dependiendo de la cantidad de daño que se genere y de la afinidad de cada operador de SOS por el represor LexA.

El aumento en la concentración de RecA no basta para que se inicien las funciones SOS, es necesario que la proteína se active para promover la degradación de LexA y así desencadenar la respuesta (Quillardet et al., 1982). Los experimentos in vitro con las proteínas reguladoras purificadas han demostrado que para estimular la actividad de co-proteasa de RecA son necesarios el DNA de una hebra y el ATP (Little, 1984). Adicionalmente, en experimentos in vivo en los que se infectaron bacterias con mutantes del fago f1, incapaces de llevar a cabo la síntesis complementaria de DNA y que permanecen como DNA de una hebra dentro de la célula, la respuesta SOS se induce, lo que demuestra que el DNA de una sola hebra activa el regulón (Higashitani et al., 1995). Esto sin embargo, explica sólo parcialmente el proceso que lleva a la inducción de SOS, ya que si bien hay una gran cantidad de agentes que alteran la estructura química del DNA, son pocos los que generan directamente las regiones de una hebra requeridas para que se active el sistema y, en general, es necesario que ocurra una serie de eventos previos. Es importante entonces explorar los pasos que se siguen desde que se origina una lesión en el DNA hasta que finalmente se activa la respuesta SOS, así como los genes que participan en ello, por ejemplo cómo se genera el DNA de una hebra para que se inicie la respuesta. Algunos trabajos anteriores muestran que al irradiar bacterias con defectos en genes como recJ y recO, sus niveles de SOS son menores que lo normal a pesar de que, a causa de estos defectos, no se llega a eliminar totalmente el daño, como lo demuestra la supervivencia de estas cepas (Breña y Serment, 1998). Los productos de los dos primeros son enzimas que a partir de rupturas dobles o bien de cortes de cadena sencilla, degradan una de las dos bandas del DNA y generan regiones de una hebra. El producto de recO actúa como parte de un complejo junto con los de recF y recR para desplazar a la proteína SSB y promover la entrada de RecA cuando se genera DNA de una hebra en la célula (Umezu y Kolodner, 1994; Whitby y Lloyd, 1995). Los datos en conjunto sugieren que las lesiones deben transformarse a huecos o rupturas en una de las dos cadenas y que estas aberturas deben estar disponibles para que las reconozca RecA e inicie la respuesta. Una vez activado el proceso aumenta la probabilidad de recuperación e inversamente disminuye la de muerte celular (Tavera et al., 2003).

Es poco probable que durante los procesos de reparación se genere el DNA de cadena sencilla que activa la respuesta. Al respecto recientemente se demostró que entre las enzimas que participan en la modificación o procesamiento de lesiones para generar el DNA de cadena sencilla que activa SOS están cuatro distintas exonucleasas de cadena sencilla, ExoI, RecJ, ExoVII y ExoX, los productos de xonA, recJ, xseA y exoX respectivamente (Serment-Guerrero et al., 2008) y se propuso un modelo para tratar de explicar el procesamiento de las lesiones producidas por la radiación gamma previo a la inducción de la respuesta. En el modelo se propone que esto es principalmente a partir de rupturas de cadena sencilla o bien de cortes producidos por la acción de endonucleasas AP como parte del mecanismo de reparación por escisión de bases. En ese aspecto y para confirmar dicha propuesta se realizarán experimentos con una cepa con defectos en la enzima ExoIII/EndoVI (codificada por el gen xth) que lleva a cabo alrededor del 90 % de los cortes en sitios abásicos (Sadigursky y Franklin, 1992).

Por otra parte las dos exonucleasas más importantes en el procesamiento de lesiones (RecJ y ExoI) previo a la activación de la respuesta SOS degradan DNA de cadena sencilla, así que en el caso de rupturas o cortes de cadena sencilla es necesario que actúe también una helicasa. Se ha demostrado que al menos para algunas de sus funciones RecJ y ExoI necesitan de la actividad de helicasas como RecQ (Hishida et al., 2004¸Han et al., 2006; Shereda et al., 2007) por lo que se planea verificar si esta enzima (u otras similares) participan en los procesos previos a la activación de SOS.

Como se dijo antes para activar la respuesta es necesario que RecA se una a DNA de cadena sencilla. Esta unión se lleva a cabo ya sea por la vía RecFOR o por RecBCD. De acuerdo a trabajos previos de este grupo SOS se activa principalmente por la vía de recombinación RecFOR mientras que cuando RecA se une a DNA de cadena sencilla con la ayuda de RecBCD se va principalmente a recombinación. Una de las diferencias entre ambos mecanismos es la presencia de la proteína Ssb, ya que RecBCD carga a RecA sobre este tipo de estructuras directamente sin la intervención de Ssb, mientras que en la vía RecFOR, RecA sustituye a dicha proteína. Es posible entonces que la proteína Ssb sea la responsable de decidir si el filamento de RecA-DNA vaya a recombinación o a la activación de SOS (Kuzminov, 1999), por lo que sería importante estudiar su participación en dichos eventos.

El modelo antes mencionado trata de explicar el procesamiento de las lesiones producidas por radiación gamma, sin embargo es posible que dicho procesamiento cambie dependiendo del tipo de lesiones que se generen por lo que es importante investigar si las exonucleasas estudiadas juegan el mismo papel en lesiones producidas por otros tipos de agentes genotóxicos. En ese aspecto se observó en experimentos preliminares que la cepa defectuosa en RecJ se comporta de un modo distinto cuando se les expone a luz ultravioleta (que produce principalmente los enlaces intra-banda conocidos como dímeros de pirimidina, que bloquean a la polimerasa III durante la duplicación del DNA), por lo que resulta interesante estudiar lo que ocurre en los mutantes defectuosos en las diferentes exonucleasas de cadena sencilla.

A pesar de que las lesiones que producen los distintos tipos de radiación ionizante son semejantes, la distribución de estos daños no es igual lo que representa un papel muy importante en las consecuencias biológicas. Así por ejemplo, hay casos en que se concentran en determinados puntos del genoma dando lugar a daño agrupado (complex o clustered damage en inglés) definido como dos o más lesiones por vuelta de hélice (Goodhead, 1994; Gulston et al, 2002; Sutherland et al., 2002). La probabilidad de que esto ocurra aumenta en función de la dosis o del potencial de ionización de la radiación (Breña et al., 1996; 1998). Hay además evidencias de que esta clase de daño se presenta incluso a dosis de radiación bajas (Sutherland et al., 2002; Shikazono et al., 2006). Las consecuencias en cuanto al efecto biológico son serias ya que estas lesiones son más difíciles de reparar y a la larga dan lugar a rupturas dobles, letales para la célula o posibles causantes de eventos de recombinación que implican mutación y transformación celular en los tejidos que a su vez den lugar a la formación de tumores cancerosos (Jenner et al., 2001 Bennet et al., 2004; Gulston et al, 2004.). Por ello es importante contar con protocolos que ayuden a establecer tanto las consecuencias de las lesiones como los sistemas de reparación que participen en su eliminación. Algunos resultados de trabajos en donde se compara la respuesta de diferentes cepas de E. coli a radiaciones de alto y bajo LET sugieren que de acuerdo a dicha respuesta es posible discriminar entre lesiones complejas y lesiones simples (Tavera et al., 2003). Durante el desarrollo de este proyecto se planea exponer a radiación de bajo (rayos gamma) o de alto LET (partículas alfa), a cepas de E. coli con defectos en diferentes genes. Se comparará la actividad SOS que refleja daño sencillo y reparable con la formación de rupturas dobles expresadas en la fracción de supervivencia y que es producto de daño complejo no reparable para establecer la importancia de los genes hasta ahora estudiados en la recuperación celular a de este tipo de daño.

Por otra parte, una de las consecuencias del daño genético es la aparición de mutaciones, esto es, cambios en la secuencia de bases del DNA que pueden provocar variaciones en la actividad de los genes. Desde la publicación del libro El Origen de las Especies de Charles Darwin en 1859, se ha acumulado una gran cantidad de evidencias que apoyan la teoría de la evolución por selección natural, dada por la aparición de mutaciones fortuitas que confieren a los organismos mayores oportunidades de adaptación a un medio hostil. Cuando la radiación ultravioleta (UV) se utiliza en el laboratorio como agente selectivo de bacterias como Escherichia coli, comúnmente se seleccionan poblaciones resistentes a los efectos letales de este tipo de radiación. La inducción de resistencia a radiación UV en E. coli puede ser vista entonces como un caso de evolución adaptativa que ocurre mediante un proceso de mutación y selección, cuya sencillez y reproducibilidad lo hacen un modelo experimental adecuado para simular la evolución adaptativa de poblaciones independientes bajo fuerte presión selectiva. Se propone analizar los cambios en la secuencia del ADN de E. coli durante la adaptación de poblaciones independientes a irradiación crónica con luz UV a fin de determinar los genes participantes en la adaptación a ese ambiente. Existen ya antecedentes de este experimento en el trabajo publicado por Alcántara, Breña y Serment en 2004, en el que se presentaron resultados de un estudio realizado en cinco poblaciones de E. coli resistentes a radiación obtenidas después de 80 ciclos de irradiación con luz UV. La diversidad de los niveles de resistencia alcanzados en esas 5 poblaciones y los datos obtenidos en el mapeo genético mediante la técnica de gradientes de transmisión llevaron a la conclusión de que los genes, y por lo tanto los mecanismos celulares involucrados, eran diferentes en las distintas poblaciones y de que en cada caso la resistencia a radiación se debía a la selección de una sola mutación en genes relacionados con reparación y replicación del ADN.

En los últimos años se han desarrollado diversas tecnologías que se enfocan en la utilización de la energía acumulada en la biomasa de desechos, para ser redirigida a otras formas de energía que la humanidad pueda utilizar como son: la metanogénesis (CH4), el biohidrógeno (H2) y la bioelectricidad (Logan et al., 2006). Las celdas de combustible microbianas, conocidas también como MFC por sus siglas en inglés (Microbial Fuel Cell), resultan ser una opción prometedora para la generación de energía renovable que se pueda emplear como electricidad (Logan & Regan, 2006). Avances importantes se han logrado para incrementar la eficiencia de estos dispositivos tanto para la generación de electricidad como para la generación de hidrógeno, empleándolas como celdas de electrólisis microbianas o MEC por sus siglas en inglés (Microbial Electrochemical Cell) (Liu et al.,2005b). Una gran variedad de substratos se han empleado en el ánodo para la generación de energía, incluyendo acetato, celulosa, aguas residuales municipales e industriales, etc. Se ha mejorado la tecnología y funcionamiento de la celda misma, sin embargo un factor común y que tiene gran relevancia, es la formación de la biopelícula microbiana en el ánodo (Kim et al., 2006). Se han identificado y caracterizado el tipo de organismos que conforman los consorcios bacterianos que participan en la formación de la biopelícula y de manera importante en el aporte de energía (Lovley, 2008).

En la Fotografía se muestra las Alternativas de procesamiento de lesiones en el DNA producidas por radiación gamma previos a la inducción de SOS. En el lado izquierdo: las rupturas dobles parejas son reconocidas por RecBCD para dar lugar principalmente a reparación por recombinación, y sólo una pequeña parte daría lugar a SOS como lo indica la línea punteada. Al centro: los cortes de cadena sencilla son procesados por exonucleasas (principalmente ExoI y RecJ) y con la intervención de SSB y RecFOR generan el sustrato que activa SOS. Del lado derecho: las bases dañadas son reconocidas y procesadas por diferentes glucosidasas y endonucleasas AP dando lugar a cortes de cadena sencilla que seguirían la misma ruta descrita en la parte central del modelo.

Beneficios:

Adquirir conocimientos acerca de los mecanismos de activación de la respuesta SOS en Escherichia coli. Estudiar la importancia del tipo de radiaciones en el daño al DNA al irradiar sistemas biológicos. Sentar las bases para el estudio del uso de bacterias como generadoras de electricidad en el instituto.

Logros Obtenidos:

1. Serment-Guerrero J, Breña-Valle M, Aguilar-Moreno M, Balcázar M (2012). Evidence of DNA double strand breaks formation in Escherichia coli bacteria exposed to alpha particles of different LET assessed by the SOS response.  Applied Radiation and Isotopes, 71:66-70. DOI 10.1016/j.apradiso.2012.05.007.
2. Serment-Guerrero J, Alcántara-Díaz D, Martínez-Martínez E (2013). Participación de diferentes genes en la reparación de rupturas de doble cadena en cepas de Escherichia coli expuestas a radiación gamma. Revista Internacional de Contaminación Ambiental 29, (1):47-57.

Aplicaciones:

Al conocer los mecanismos de activación de la respuesta SOS en Escherichia coli, se pueden crear métodos para reforzar los mecanismos de reparación celular.